fa ساخت پلاسمید نوترکیب بیان کننده ژن AID تحت کنترل پروموتر حساس به حرارت باکتریوفاژ لامبدا ايمونولوژي Immunology پژوهشي-کامل Research(Original) <span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">سابقه</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;"> و هدف:</span></span></span> <span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="font-family:b zar;">آنزیم</span></span> <span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="font-size:10.0pt;">Activation-induced cytidine deaminase (AID)</span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="font-family:b zar;"> یک آنزیم اختصاصی لنفوسیت<span style="color:black;">‌</span>های</span></span><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="font-size:10.0pt;">B </span></span>&nbsp;<span style="font-family:b zar;">در هایپرموتاسیون سوماتیک و نوترکیبی تعویض کلاس ژن<span style="color:black;">‌</span>های آنتی<span style="color:black;">‌</span>بادی در فولیکول های لنفوسیت </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">B</span></span><span style="font-family:b zar;"> ارگان های لنفاوی محیطی</span><span style="font-family:b zar;"> می<span style="color:black;">‌</span>باشد. بیان نا به جای این آنزیم منجر به موتاسیون در سلول<span style="color:black;">‌</span>های غیر از لنفوسیت<span style="color:black;">‌</span>های </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">B</span></span><span style="font-family:b zar;"> و حتی در باکتری </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">Escherichia coli</span></span><span style="font-family:b zar;"> شده است. با این وجود، القای موتاسیون در باکتری </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">Escherichia coli </span></span><span style="font-family:b zar;">&nbsp;توسط بیان آنزیم </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">AID</span></span><span style="font-family:b zar;">، نیازمند بهینه سازی شرایط مطلوب و کنترل شده می باشد. <span style="letter-spacing:-.1pt;">بنابراین هدف این مطالعه تولید</span> یک پلاسمید&nbsp; بیانی </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">AID</span></span><span style="font-family:b zar;"> تحت کنترل پروموتر حساس به حرارت از باکتریوفاژ لامبدا می<span style="color:black;">‌</span>باشد.</span><br> <span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">مواد و روش</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;">‌</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">ها:</span></span></span> <span style="font-family:b zar;">در مرحله اول، جداسازی ژن </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">AID</span></span><span style="font-family:b zar;"> از پلاسمید نوترکیب </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">PGEMT</span></span><span style="font-family:b zar;"> حاوی </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">AID</span></span><span style="font-family:b zar;"> انجام شد. ژن تخلیص شده در پلاسمید </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">PTG19-T</span></span><span style="font-family:b zar;"> در باکتری </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E.coli</span></span><span style="font-family:b zar;"> سوش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">Top10</span></span><span style="font-family:b zar;"> کلون شد و سپس در یک پلاسمید بیانی القایی با دما حاوی پروموتر چپ باکتریوفاژ لامبدا و رپرسور حساس به حرارت </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">cI857</span></span><span style="font-family:b zar;"> منتقل و در باکتری </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">E.coli</span></span><span style="font-family:b zar;"> قرار داده شد. در مرحله آخر، ژن مقاومت به تتراسایکلین جایگزین ژن مقاومت این پلاسمید نوترکیب شد. </span><br> <span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">یافته</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;">‌</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">ها:</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;"> ژن </span></span></span><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:10.0pt;">AID</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;"> در پلاسمید حاوی رپرسور حساس به حرارت </span></span></span><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:10.0pt;">cI857</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;"> از باکتریوفاژ لامبدا انتقال یافت. صحت توالی و </span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;"><span style="font-size:11.5pt;">چارچوب خوانش توسط </span></span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;"><span style="font-size:11.5pt;">الکتروفورز</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;"> محصول</span></span><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;">، استفاده از روش<span style="color:black;">‌</span>های هضم آنزیمی وهمچنین تعیین توالی ژن</span></span><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-size:10.0pt;">AID</span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;">، تایید شد.</span></span><br> <span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">استنتاج:</span></span></span><span style="font-family:b zar;"> ژن </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">AID</span></span><span style="font-family:b zar;"> به<span style="color:black;">‌</span>طور موفقیت<span style="color:black;">‌</span>آمیزی در پلاسمید حاوی پروموتر حساس به حرا</span><span style="font-family:b zar;">ر</span><span style="font-family:b zar;">ت از باکتریوفاژ لامبدا کلون شد. </span><span style="font-family:b zar;">این پلاسمید نوترکیب می تواند در سویه های مختلف باکتری</span><u><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:10.0pt;">E.coli </span></span></span></u><span style="font-family:b zar;">&nbsp;جهت تولید سویه های </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">mutator</span></span><span style="font-family:b zar;"> استفاده شود.</span><br> &nbsp; <strong>Background and purpose:</strong> Activation-induced cytidine deaminase (AID) is a B-cell specific enzyme responsible for somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) of antibody genes within the B-cell follicle of peripheral lymphoid organs. Ectopic overexpression of the enzyme leads to mutations in non-B cells and <em>Escherichia coli</em> (<em>E.coli</em>) genes. However, induction of mutations in <em>E.coli</em> by expression of AID requires highly regulated conditions. Therefore, the aim of this study was to construct a plasmid expressing AID under the control of tightly regulated temperature-sensitive promoter of bacteriophage lambda..<br> <strong>Materials and methods:</strong> The AID gene was isolated from PGEMT recombinant plasmid, containing AID and cloned into PTG19-T vector. Then, AID was ligated to an expression plasmid under the control of left promoter of bacteriophage lambda and mutant thermolabile cI857 repressor. Finally, the resistance marker of the engineered plasmid was replaced by tetracycline resistance gene.<br> <strong>Results:</strong> The whole open reading frame of AID was ligated into a plasmid containing a cI857-sensitive receptor lambda bacteriophage. The sequence and reading frame accuracy of the cloning was confirmed by electrophoresis of PCR products on agarose gel, restriction enzyme digestion, and nucleotide sequencing methods.<br> <strong>Conclusion:</strong> In current study, the AID was successfully cloned into an expression plasmid containing thermo-sensitive promoter of bacteriophage lambda. The recombinant plasmid could be used in different strains of <em>E.coli</em> to produce mutator strains.<br> &nbsp; AID, سویه mutator, پروموتر چپ فاژ لامبدا AID, mutator strain, lambda PL promoter 100 109 http://jmums.mazums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3030-3&slc_lang=fa&sid=1 Nasim Hafezi نسیم حافظی 1003194753284600104827 1003194753284600104827 No PhD Student in Immunology, Faculty of Medicine, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran PhD Student in Immunology, Molecular and Cell Biology Research Center, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran دانشجوی دکترای ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران دانشجوی دکترای ایمونولوژی، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Abolghasem Ajami ابوالقاسم عجمی 1003194753284600104828 1003194753284600104828 No Professors, Department of Immunology, Faculty of Medicine, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran Professors, Molecular and Cell Biology Research Center, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran استاد، گروه ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران استاد، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Reza Valadan رضا ولدان valadan.reza@hmail.com 1003194753284600104829 1003194753284600104829 Yes Assistant Professor, Department of Immunology, Faculty of Medicine, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran Assistant Professor, Molecular and Cell Biology Research Center, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran استادیار، گروه ایمونولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران استادیار، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی مولکولی دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران