fa آنالیز منحنی ذوب DNA با کیفیت بالا (HRM) به منظور شناسایی استافیلوکوک اورئوس و سویه مقاوم به متی سیلین ميکروبيولوژي Microbiology پژوهشي-کامل Research(Original) <span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">سابقه</span></span></span><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;"> و هدف:</span></span></span><span style="font-family:b zar;"> آنالیز منحنی ذوب </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">DNA</span></span><span style="font-family:b zar;"> با کیفیت بالا (</span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">HRM</span></span><span style="font-family:b zar;">) یکی از حساس</span><span style="font-family:b zar;">‌</span><span style="font-family:b zar;">ترین و دقیق</span><span style="font-family:b zar;">‌</span><span style="font-family:b zar;">ترین روش</span><span style="font-family:b zar;">‌</span><span style="font-family:b zar;">ها جهت شناسایی <em>استافیلوکوک اورئوس</em> و مقاومت به متی سیلین است. این مطالعه با هدف آنالیز منحنی ذوب </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">DNA</span></span><span style="font-family:b zar;"> با کیفیت بالا، به منظور شناسایی سویه های <em>استافیلوکوک اورئوس</em> مقاوم به متی سیلین انجام پذیرفت.</span><br> <span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">مواد و روش</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;">‌</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">ها:</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;"> در این مطالعه تجربی، از سویه</span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;">‌</span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;">های استاندارد <em>استافیلوکوک اورئوس</em> </span></span><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-size:10.0pt;">ATCC25923</span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-family:b zar;"> و </span></span><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="font-size:10.0pt;">ATCC 33592</span></span><span style="font-family:b zar;"> استفاده شد. جهت شناسایی <em>استافیلوکوک اورئوس</em> از ژن </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">ITS</span></span></em><span style="font-family:b zar;">، و مقاومت به متی</span><span style="font-family:b zar;">‌</span><span style="font-family:b zar;">سیلین از ژن </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">mecA</span></span></em><span style="font-family:b zar;"> استفاده گردید. با استفاده از نرم</span><span style="font-family:b zar;">‌</span><span style="font-family:b zar;">افزارهای </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">StepOne Software v2.3</span></span><span style="font-family:b zar;"> و </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">HRM Software v3.0.1</span></span><span style="font-family:b zar;"> تجزیه و تحلیل انجام شد و نتایج تعیین توالی به عنوان گلد ‌استاندارد مورد استفاده قرار گرفت.</span><br> <span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">یافته</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b zar;">‌</span></span></span><span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">ها:</span></span></span> <span style="font-family:b zar;">حساسیت آنالیتیکی روش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span><span style="font-family:b zar;"> با استفاده از پرایمر </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">ITS</span></span></em><span style="font-family:b zar;"> قادر به شناسایی </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">CFU</span></span><span style="font-family:b zar;"> 10⁴ باکتری بوده و برای ژن </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">mecA</span></span></em><span style="font-family:b zar;"> تا </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">CFU</span></span><span style="font-family:b zar;"> 10³ باکتری را تشخیص داد. حسایت آنالیتیکی روش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">HRM</span></span><span style="font-family:b zar;"> نیز برای پرایمر ژن </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">ITS</span></span></em><span style="font-family:b zar;"> تا رقت </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">CFU</span></span><span style="font-family:b zar;"> ^2-</span>10 و پرایمر ژن <em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">mecA</span></span></em><span style="font-family:b zar;"> تا رقت </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">CFU</span></span><span style="font-family:b zar;"> ^5-</span>10 قدرت شناسایی باکتری را داشته است. در تجزیه و تحلیل نتایج <span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">HRM</span></span><span style="font-family:b zar;"> نیز کم</span><span style="font-family:b zar;">‌</span><span style="font-family:b zar;">ترین مقدار خطا در منحنی</span><span style="font-family:b zar;">‌</span><span style="font-family:b zar;">ها ذوب </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">DNA</span></span><span style="font-family:b zar;"> مشاهده گردید به طوری که، با در نظر گرفتن نزدیک ترین بازه دمایی به منظور تجزیه و تحلیل، دمای ذوب برای ژن </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">ITS</span></span></em><span style="font-family:b zar;"> مقدار 5/0</span><span style="font-size:10.0pt;">&plusmn;</span><span style="font-family:b zar;"> 86 درجه سلسیوس و برای ژن </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">mecA</span></span></em><span style="font-family:b zar;"> مقدار 5/0</span><span style="font-family:cambria,serif;">&plusmn;</span><span style="font-family:b zar;"> 81 درجه سلسیوس ب</span><span style="font-family:b zar;">ه </span><span style="font-family:b zar;">دست آمد. نتایج دما و تعیین توالی اختصاصیت بالای روش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">HRM</span></span><span style="font-family:b zar;"> را نشان داد.</span><br> <span style="letter-spacing:-.2pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b koodak;">استنتاج:</span></span></span><span style="font-family:b zar;"> روش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">HRM</span></span><span style="font-family:b zar;"> از نظر تشخیص مقدار کم باکتری، دارای حساسیت و اختصاصیت بالایی می باشد.</span><br> &nbsp; <strong>Background and purpose:</strong> High Resolution Melting curve analysis DNA (HRM) is one of the most sensitive and precise methods for detecting <em>Staphylococcus aureus</em> and resistance to Methicillin. The aim of this study was to analyze the HRM for detection of methicillin-resistant <em>S. aureus</em> strains.<br> <strong>Materials and methods:</strong> In this experimental study, standard strains of <em>S.aureus</em> ATCC25923 and ATCC 33592 were used. To identify <em>S.aureus</em> from <em>ITS</em> gene and methicillin resistance, the <em>mecA</em> gene was used. Analysis was performed using StepOne v2.3 and HRM v3.0.1. Sequencing results were used as gold standard.<br> <strong>Results:</strong> The analytical sensitivity of the PCR method by <em>ITS</em> primer was capable of detecting 10⁴ CFU bacteria and detecting bacteria for the <em>mecA</em> gene up to 10³ CFU. The analytical sensitivity of the HRM method was also valid for <em>ITS</em> gene primer to dilute 10^-2 CFU and the <em>mecA</em> gene primer up to a dilution of 10^-5 CFU to detect bacteria. In HRM analysis, the lowest error rate was observed in the melting curves of DNA. Thus, considering the closest temperature range for analysis, the melting temperature for the <em>ITS</em> gene was 86 &plusmn; 0.5&deg;C and for the <em>mecA</em> gene was 81&plusmn; 0.5&deg;C. The results of temperature and sequence determination proved the specificity of the HRM.<br> <strong>Conclusion:</strong> The HRM has high sensitivity and specificity for detecting low levels of bacteria.<br> &nbsp; استافیلوکوک اورئوس, مقاومت به متی سیلین, منحنی ذوب DNA, HRM Staphylococcus aureus, Methicillin resistance, DNA Melting Curve, HRM 83 93 http://jmums.mazums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3822-12&slc_lang=fa&sid=1 Hamed Tahmasebi حامد طهماسبی 100319475328460099100 100319475328460099100 No MSc in Medical Micobiology, Faculty of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, Zahedan, Iran کارشناس ارشد میکروب شناسی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، زاهدان، ایران Sanaz Dehbashi ساناز ده باشی 100319475328460099101 100319475328460099101 No PhD Student in Medical Bacteriology Faculty of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran دانشجوی دکتری باکتری شناسی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران Mohammad Reza Arabestani محمد رضا عربستانی mohammad.arabestani@gmail.com 100319475328460099102 100319475328460099102 Yes Associate Professor, Department of Microbiology, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran Brucellosis Research Center, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran دانشیار، گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران مرکز تحقیقات بروسلوز، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران