Journal of Mazandaran University of Medical Sciences

fa طراحی و ساخت بیوسنسور آنزیمی لکاز بر پایه اکسید گرافن و پلی‌آنیلین به منظور اندازه گیری دفستاتین Design and Fabrication of Laccase Enzyme Biosensor Based on Graphene Oxide and Polyaniline for the Measurement of Dephostatin نانوتکنولوژی Nano technology پژوهشي-کامل Research(Original) سابقه و هدف: یک بیوسنسور از دو جزء شامل عنصر حسگر زیستی و مبدل به منظور تعیین غلظت آنالیت تشکیل شده است که با انجام یک واکنش زیستی در مجاورت مبدل امکان تشخیص آن افزایش می‌یابد. از مزایای بیوسنسورها نسبت به روش‌های متداول در اندازه‌گیری آنالیت و کنترل بیوشیمی می‌توان به قابلیت استفاده مجدد، انجام سریع واکنش و ویژه بودن آن ها اشاره نمود. لکاز یکی از مهم‌ترین آنزیم‌های متعلق به خانواده اکسیدو رداکتاز هاست. خاصیت کاتالیزوری لکاز بیش تر مربوط به فعالیت آن نسبت به دی فنول‌های اورتو و پارا بوده و وابسته به نوع اورگانیسم تولیدکننده آن است. برخلاف بسیاری از آنزیم‌ها که فقط بر یک سوبسترای کاملاً اختصاصی عمل می‌کنند. این آنزیم اکسایش طیف وسیعی ازسوبستراها مانند دی فنل‌ها، پلی‌فنل‌ها، دی آمین‌ها، متوکسی فنل‌ها، آمین‌های آروماتیک و آسکوربات را کاتالیز می‌کند. پروتئین تیروزین فسفاتاز گروهی از آنزیم‌ها هستند که وظیفه حذف گروه فسفات از اسید آمینه تیروزین در پروتئین‌ها را به عهده دارد. هدف از این پروژه طراحی و ساخت بیوسنسور آنزیمی بر مبنای الکترودهای صفحه چاپی کربنی اصلاح شده با حساسیت و گزینش‌ پذیری بالای برای اندازه‌گیری دقیق و سریع دفستاتین بوده است. مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی، بیوسنسور از طریق تثبیت آنزیم لکاز بر سطح الکترود تهیه شد. برای این‌منظور در ابتدا سطح الکترود کربن چاپی استفاده از نانوکامپوزیت گرافن اکساید/ پلی‌آنیلین اصلاح شد. سپس آنزیم لکازاز طریق اتصال‌دهنده‌های EDC/NHS بر روی سطح آن تثبیت شد. رفتار الکتروشیمیایی الکترودها با استفاده از ولتامتری چرخه‌ای (CV) و امپدانس (EIS) مورد بررسی قرار گرفت. پارامترهای بهینه مانند پتاسیل اکسایش، pH، دما و غلظت بهینه شد. در پتانسیل 45/0 ولت نسبت به الکترود نقره/کلرید نقره میزان جریان هر نمونه توسط بیوسنسور، تعیین‌گردید. سپس نمودار کالیبراسیون آن رسم و ازطریق درونیابی سیگنال‌های آمپرومتریک منطبق بر منحنی‌های کالیبراسیون به‌دست آمده با محلول‌های دفستاتین، اندازه‌گیری‌ها تکمیل شد. بدون هیچ‌گونه آماده‌سازی، از نمونه‌های استاندارد دفستاتین به نمونه نسکافه رقیق شده با بافرفسفات (05/0 مولار، 5/6pH) اضافه شد و میزان بازیابی تعیین گردید. یافته‌ها: با تثبیت گرافن اکساید و آنزیم بر روی سطح الکترود میزان جریان کاتدی و آندی الکترود اصلاح شده نسبت به الکترود اصلاح نشده در محلول K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 افزایش یافت. افزایش سرعت انتقال الکترون در سطح الکترود به میزان 20 میکروآمپر مشاهده شد که در نتیجه حضور نانوذرات گرافن در سطح الکترود بود. پاسخ الکترود در محدوده 10 تا 900 نانومولار خطی گزارش شد. حد تشخیص الکترود برابر 6 نانومولار بود. استنتاج: از آن‌جا که این پروتئین‌ها در مسیرهای سیگنالینک سلولی و بروز برخی بیماری‌ها موثر هستند، استفاده از دفستاتین به عنوان داروی مهارکننده مورد توجه قرار گرفته است. از این رو ارائه روشی دقیق و سریع برای اندازه‌گیری دفستاتین از اهمیت بالایی در صنایع دارویی برخوردار است. بیوسنسور تهیه شده شامل آنزیم لکاز و نانوذرات گرافن تثبیت شده توسط نانوکامپوزیت کیتوزان بر سطح الکترود بود و جهت اندازه‌گیری دفستاتین با دقت بالا به‌کار می‌رود. آنزیم لکاز تثبیت شده بر سطح الکترود قادر است مولکول دفستاتین را به‌صورت اختصاصی اکسید کند و موجب تولید پاسخ اختصاصی الکترود نسبت به این مولکول باشد.   Background and purpose: A biosensor is composed of two main components: a biological sensing element and a transducer, which together determine the concentration of the analyte by facilitating a biological reaction near the transducer to improve detection capabilities. Compared to traditional analyte measurement and biochemical control methods, biosensors offer advantages such as reusability, fast response times, and high specificity. Laccase is a critical enzyme within the oxidoreductase family, with catalytic properties particularly effective toward ortho- and para-diphenols, depending on the producing organism. Unlike many enzymes that act exclusively on a specific substrate, laccase catalyzes the oxidation of a broad range of substrates, including diphenols, polyphenols, diamines, methoxyphenols, aromatic amines, and ascorbate. Protein tyrosine phosphatases are a class of enzymes that remove phosphate groups from tyrosine residues in proteins. This project aimed to design and develop an enzyme-based biosensor using modified screen-printed carbon electrodes with high sensitivity and selectivity for accurate and rapid dephostatin measurement. Materials and methods: The biosensor was fabricated by immobilizing laccase on the electrode surface. First, the surface of the screen-printed carbon electrode was modified with a graphene oxide/polyaniline nanocomposite, after which the laccase enzyme was immobilized on the modified surface using EDC/NHS linkers. Electrochemical characteristics of the electrodes were assessed using cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). Optimal parameters, including oxidation potential, pH, temperature, and concentration, were calibrated. At an oxidation potential of 0.45 V relative to the Ag/AgCl electrode, the current response for each sample was measured with the biosensor. Calibration curves were generated, and measurements were obtained by interpolating the amperometric signals from dephostatin solutions. Dephostatin standards were then introduced to the diluted Nescafe sample (phosphate buffer, 0.05 M, pH 6.5) without any pretreatment, and recovery rates were calculated. Results: By immobilizing graphene oxide and laccase on the electrode surface, the modified electrode exhibited increased cathodic and anodic currents compared to the unmodified electrode in K₄Fe(CN)₆/K₃Fe(CN)₆ solution. Due to the presence of graphene nanoparticles on the electrode surface, the electron transfer rate improved, as indicated by a 20 µA increase. The electrode response was linear across a concentration range of 10 to 900 nM, with a detection limit of 6 nM. Conclusion: Since protein tyrosine phosphatases play essential roles in cell signaling pathways and disease development, the use of dephostatin as an inhibitor has gained interest. Therefore, an accurate and rapid method for dephostatin measurement is crucial in the pharmaceutical industry. The prepared biosensor, which incorporates laccase enzyme and graphene nanoparticles stabilized with a chitosan nanocomposite, allows for precise dephostatin measurement. The laccase enzyme immobilized on the electrode surface can specifically oxidize the dephostatin molecule, producing a unique electrode response for this molecule.   بیوسنسور, آنزیم, لکاز, دفستاتین, گرافن biosensor, enzyme, laccase, dephostatin, graphene 15 26 http://jmums.mazums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-14571-2&slc_lang=fa&sid=1 Mitra Ghodrati Shahtouri میترا قدرتی شاهتوری mitraghodrati1992@yahoo.com 1003194753284600173858 1003194753284600173858 No PhD Candidate in Food Safety and Quality Control, Research Institute of Food Science and Technology (RIFST), Mashhad, Iran دانشجوی دکترای ایمنی و کنترل کیفیت مواد غذایی، موسسه پژوهشی علوم و صنایع غذایی، مشهد ایران Hamed Fathi حامد فتحی fatham010@yahoo.com 1003194753284600173859 1003194753284600173859 No MSc in Biology, Pharmaceutical Sciences Research Center, Hemoglobinopathy Institute, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran کارشناس ارشد زیست شناسی، مرکز تحقیقات علوم داروئی، پژوهشکده هموگلوبینوپاتی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Davod Ilbeigi داود ایل بیگی fatham010@gmail.com 1003194753284600173860 1003194753284600173860 No Assistant Professor, Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Torbat Hedariyeh University of Medical Sciences, Torbat Hedariyeh, Iran استادیار، گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تربت حیدریه، تربت حیدریه، ایران Mehdi Mogharabi-Manzari مهدی مقربی منظری m.mogharabi@mazums.ac.ir 1003194753284600173861 1003194753284600173861 Yes Assistant Professor, Pharmaceutical Sciences Research Center, Hemoglobinopathy Institute, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran استادیار، مرکز تحقیقات علوم داروئی، پژوهشکده هموگلوبینوپاتی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Ebrahim Fooladi ابراهیم فولادی e.fooladi@rifst.ac.ir 1003194753284600173862 1003194753284600173862 No Assistant Professor, Department of Food Safety and Quality Control, Research Institute of Food Science and Technology (RIFST), Mashhad, Iran استادیار، گروه ایمنی و کنترل کیفیت مواد غذایی، موسسه پژوهشی علوم و صنایع غذایی، مشهد ایران