fa کلونینگ، بیان، خالص سازی و ارزیابی آنزیم لیزواستافین نوترکیب با استفاده از سیستم کلونینگ pBAD ميکروبيولوژي Microbiology پژوهشي-کامل Research(Original) سابقه و هدف: استافیلوکوک اورئوس یک پاتوژن مهم بیمارستانی بوده و باعث ایجاد بیماری‌هایی همچون اندوکاردیت، استئومیلیت، پنومونی، سندرم شوک سمّی و مسمومیت غذایی می‌گردد. امروزه استفاده بیش از حد و نامناسب از آنتی‌بیوتیک‌ها در درمان این بیماری‌ها باعث مقاومت این ارگانیسم به بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌ها شده است. لیزواستافین به عنوان یک عامل موثر و اختصاصی در درمان عفونت‌های استافیلوکوکی محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه تولید لیزواستافین نوترکیب با استفاده از سیستم کلونینگ pBAD می باشد. مواد و روش‌ها: در مرحله اوّل، ساخت پلاسمید نوترکیب pBAD با استفاده از سیستم pBAD/Thio-TOPO تحت عنوان pBADLys انجام گرفت. سپس به منظور بیان ژن لیزواستافین از آزمون Reverse Transcriptase PCR استفاده گردید. در مرحله بعد، بیان لیزواستافین نوترکیب در سیستم pBAD انجام شد که بیان پروتئین با ال-آرابینوز در غلظت نهایی 2/0 درصد القاﺀ گردید. سپس خالص سازی آنزیم با استفاده از ستون Ni-NTA agarose (Qiagene, Hilden, Germany) انجام گرفت و در نهایت بررسی فعالیت آنزیمی با استفاده از محیط مولر هینتون آگار و ایجاد هاله عدم رشد مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها: با توجه به نتایج حاصل شده از PCR و تعیین توالی، پلاسمید نوترکیبpBAD با موفقیت ساخته شد. بیان پروتئین با استفاده از ال-آرابینوز در غلظت نهایی 2/0 درصد به خوبی القاﺀ و غلظت بسیار بالایی از آنزیم نوترکیب با استفاده از سیستم کروماتوگرافی ستونی نیکل حاصل گردید. لیزواستافین نوترکیب دارای فعالیت بسیار اختصاصی بر علیه استافیلوکوکوس اورئوس می باشد. استنتاج: آنزیم لیزواستافین نوترکیب حاصل شده با استفاده از سیستم بیانی pBAD با توجه به میزان حاصل شده بسیار مقرون به صرفه از نظر هزینه می باشد و همچنین با عملکرد اختصاصی بر روی استافیلوکوکوس اورئوس بسیار موثر است. Background and purpose: Staphylococcus aureus is an important nosocomial pathogen which causes some diseases such as endocarditis, osteomyelitis, pneumonia, toxic shock syndrome, and food poisoning. The excessive and inappropriate use of antibiotics in the treatment of these diseases causes resistance to many antibiotics. Lysostaphin is an effective agent in the treatment of staphylococcal infections. The purpose of this study was to produce recombinant lysostaphin using pBAD cloning system. Materials and methods: In first phase, the recombinant plasmid pBAD was built using pBAD/ Thio-TOPO system (pBAD). Then, the gene expression of lysostaphin was determined by Reverse Transcriptase-test. Afterwards, the gene expression was induced by l (+) - arabinose to a final concentration of 0.2% and the expressed protein was purified by affinity- chromotagraphy using Ni-NTA agarose (Qiagen, Hilden, Germany). Finally, the enzyme activity was evaluated by Mueller Hinton agar medium and inhibition zone was measured. Results: The results of PCR and sequencing confirmed that the recombinant plasmid pBAD was created successfully. Protein expression using the l (+) - arabinose to a final concentration of 0.2% induced a very high concentration of the recombinant enzyme. Lysostaphin recombinant was found with highly specific activity against Staphylococcus aureus. Conclusion: Lysostaphin recombinant enzyme using pBAD expression system is very cost effective and highly active against Staphylococcus aureus. لیزواستافین, پروتئین نوترکیب, استافیلوکوک Lysostaphin, recombinant proteins, Staphylococcus 18 28 http://jmums.mazums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-29-340&slc_lang=fa&sid=1 Alireza Mordadi علیرضا مردادی 100319475328460051946 100319475328460051946 No MSc Student in Medical Microbiology, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Hamedan University of Medical Sciences, Hamedan, Iran دانشجوی کارشناسی ارشد میکوب شناسی، گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران Fahimeh Haji Ahmadi فهیمه حاجی احمدی 100319475328460051947 100319475328460051947 No PhD Student in Medical Bacteriology, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Hamedan University of Medical Sciences, Hamedan, Iran دانشجوی دکتری تخصصی باکتری شناسی، گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران Sara Soleimani Asl سارا سلیمانی اصل 100319475328460051948 100319475328460051948 No Assistant Professor, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Hamedan University of Medical Sciences, Hamedan, Iran استادیار، گروه آناتومی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران Mohammd Reza Arabestani محمدرضا عربستانی mohammad.arabestani@gmail.com 100319475328460051949 100319475328460051949 Yes Assistant Professor, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Hamedan University of Medical Sciences, Hamedan, Iran استادیار، گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران Piotr Szweda پیوتر ژودا 100319475328460051950 100319475328460051950 No Assistant Professor, Brucellosis Research Centre, Faculty of Medicine, Hamedan University of Medical Sciences, Hamedan, Iran . استادیار، مرکز تحقیقات بروسلوز، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران