Journal of Mazandaran University of Medical Sciences

fa طراحی وکتور لنتی ویروسی pLEX-LAMP-DARPin جهت بیان دارپین هدفمند علیه HER2 در سطح اگزوزوم Designing pLEX-LAMP-DARPin Lentiviral Vector for Exression of HER2 Targeted DARPin on Exosome Surface بیوتکنولوژی Biotechnology پژوهشي-کامل Research(Original) سابقه و هدف: سلول‌های زنده به‌منظور ارتباط با محیط اطرافشان نانوذرات اگزوزومی آزاد می‌کنند.امروزه اگزوزوم به عنوان حامل دارو در تحقیقات مطرح است. این ذرات را می‌توان با بیان لیگاند مخصوص سرطان/بیماری هدفمند ساخت. پروتئین اتصالی غشا LAMP که در اگزوزوم بیان می‌شود بهترین انتخاب به عنوان نگهدارنده لیگاندی است که می‌تواند به رسپتورهای اختصاصی سلول هدف متصل گردد. هدف از این مطالعه طراحی وکتور لنتی ویروسی بوده است که حامل ژن کایمر جهت بیان پروتئین کایمر LAMP-DARPin در سطح اگزوزوم برای اتصال به گیرنده‌های HER2 در سطح سلول‌های سرطانی است. مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی با RNA استخراج شده از ماهیچه اسکلتی موش cDNA سنتز گردید وبا پرایمرهای اختصاصی، ژن LAMP2b تکثیر گردید. با روش SOEing PCR دو سایت برش بین توالی کد‌کننده سیگنال پپتید وپپتید بالغ ایجاد شد وسپس در وکتور لنتی ویروسی pLEX کلون شد. ژن دارپین طراحی ،اپتیمایز ، سنتزودر وکتور pLEX-LAMP بین توالی سیگنال وپپتید بالغ کلون شد و کلونیگ با colony-PCR با تعیین توالی تایید شد. یافته‌ها: ژل الکتروفورز محصول واکنش SOEing PCR، بیان‌گرتکثیر بخش کد‌کننده ژن LAMP2b است. بعد از کلونیگ وجداسازی پلاسمید از کلون‌های مثبت ،تعیین توالی انجام شد که بلاست توالی در NCBI تایید کننده توالی ژن LAMP2b است.هم‌چنین ورود توالی دارپین بین توالی پپتید سیگنال و پپتید بالغ به‌وسیله الکتروفورز وتوالی‌یابی تایید شد. استنتاج: در این مطالعه وکتور لنتی ویروسی PLEX LAMP-DARPin طراحی گردید که با کمک آن می‌توان لیگاند دارپین را جهت هدفگیری سلول‌های سرطا نی HER2 مثبت در سطح اگزوزوم بیان نمود.   Background and purpose: Exosome as drug delivery system is a novel and smart methodology enabling delivery of exosome cargo into specific tissue. This aim could be accessed by manipulation of exosome producer cells for expression of specific transmembrane-anchored ligand on exosomes surface. Accordingly, Lysosomal Associated Membrane Protein (LAMP) is one of the best choices for anchoring and chimerization with any ligand for this propose. In current study we designed a lentiviral vector which carries a chimeric gene for expression of LAMP2-DARPin in exosome to attach to HER2 on cancer cell surfaces. Materials and methods: RNA was extracted from mouse skeletal muscle, then, cDNA was produced by RT-PCR and CDS of LAMP2b gene was amplified by specific primers. Two restriction sites were introduced between signal and mature peptide sequence by SOEing PCR. This fragment was inserted into pLEX-MCS lentiviral vector and cloned in E.coli. DARPin gene was designed, optimized and synthesized, then cloned between signal and mature peptide. Positive clone was confirmed by colony PCR and DNA sequencing. Results: Electrophoresis of SOEing PCR product showed 1290 bp DNA fragment of LAMP2B CDS. Insertion of LAMP2 in pLEX vector was confirmed by electrophoresis and sequencing. Accordingly, DARPins was synthesized and inserted into pLEX-LAMP vector, electrophoresis and sequencing of purified plasmid from positive clone confirmed the insertion of DARPins into pLEX-LAMP vector. Conclusion: We generated two lentiviral vectors, pLEX-LAMP for expression of any ligands in exosome surface and pLEX-LAMP DARPin for expression of DARPin on exosome surface for HER2 targeting.   اگزوزوم,وکتور لنتی ویروسی ,دارپین, SOEing PCR,LAMP2b exosome, lentiviral vector, DARPins, SOEing PCR, LAMP2b 12 23 http://jmums.mazums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-7694-1&slc_lang=fa&sid=1 Shabanali Khodashenas Limoni شعبانعلی خداشناس لیمونی 100319475328460083538 100319475328460083538 No Assistant Professor, Immunogenetic Research Center, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran استادیار، مرکز تحقیقات ایمونوژنتیک، دانشگاه علوم پزشکی مازندران،ساری، ایران Fatemeh Salimi فاطمه سلیمی 100319475328460083539 100319475328460083539 No PhD Student in Medical Biotechnology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی پزشکی، گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران Mehdi Forouzandeh Moghaddam مهدی فروزنده مقدم foroz@modares.ac.ir 100319475328460083540 100319475328460083540 Yes Associate Professor, Department of Medical Biotechnology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran دانشیار، گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران