Journal of Mazandaran University of Medical Sciences

fa استفاده از سرم اتولوگ به عنوان جایگزین سرم جنین گاوی در گسترش سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از خون قاعدگی The Utilization of Autologous Serum as a Substitute of Fetal Bovine Serum in the Expansion of Mesenchymal Stem Cells Derived from Menstrual Blood بیوتکنولوژی Biotechnology پژوهشي-کامل Research(Original) سابقه و هدف: سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از خون قاعدگی (MB-MSCs)، اخیرا معرفی شده و بیان‌کننده مارکرهای CD44، CD90 و CD105 هستند. این سلول‌ها به علت جمع‌آوری آسان و بدون هیچ‌گونه مداخله جراحی تهاجمی و نداشتن هیچ گونه مسئله اخلاقی منبع خوبی از سلول‌های بنیادی برای تحقیقات و استفاده در پزشکی بازساختی هستند. کشت سلولی یکی از مهم‌ترین تکنیک‌ها در زیست شناسی سلولی مولکولی است و محیط کشت مهم‌ترین جزء است. سرم یکی از اجزای مهم محیط کشت و یک محلول محافظت‌کننده است. یکی از رایج‌ترین سرم‌های مورد استفاده در کشت سلول، سرم جنین گاوی(FBS) است. این سرم مخلوطی نامشخص است و می‌تواند حاوی فاکتورهای نامطلوبی مانند اندوتوکسین، مایکوپلاسما، آلاینده‌های ویروسی یا پروتئین‌های پریون باشد. بنابراین، نیاز به جایگزینی انسانی برای FBS وجود دارد که بتوان از آن برای کاربردهای بالینی استفاده کرد. در این مطالعه، یک پروتکل انسانی با استفاده از سرم اتولوگ (AS) به جای FBS برای بررسی رشد MB-MSCs و اگزوزوم‌های آزاد شده از این سلول‌ها آزمایش می‌شود. مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی، در روز دوم قاعدگی، نمونه خون قاعدگی از اهداکننده جمع‌آوری شد. نمونه سرم اتولوگ نیز برای تهیه محیط کشت جمع‌آوری شد. ابتدا، سلول‌های بنیادی مزانشیمی از خون قاعدگی استخراج و سپس در محیطی غنی شده با سرم اتولوگ در غلظت‌های مختلف 10، 15 و 20 درصد کشت داده شدند. بررسی بر روی سلول‌های حاصل شده در پاساژ سوم صورت گرفت. سلول‌های کشت داده شده در سرم اتولوگ از لحاظ رشد و بیان مارکرهای سطحی مزانشیمی (CD73 و CD105) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. برای بررسی رشد از میکروسکوپ اینورت و از فلوسایتومتری برای بررسی بیان مارکرهای مزانشیمی استفاده شد. هم‌چنین در گام بعدی محیط کشت سلول‌های کشت داده شده در سرم اتولوگ برای جداسازی اگزوزوم جمع‌آوری شد. جداسازی اگزوزوم از یک روش ترکیبی سه مرحله‌ای رسوب‌دهی، سایز اکسکلوژن کروماتوگرافی با رزین سفارز CL-2B و تغلیظ صورت گرفت. در نهایت اگزوزوم‌های خالص‌سازی شده از نظر مورفولوژی، اندازه و بیان مارکرهای CD9، CD63 و CD81 بررسی شدند. به ترتیب از آنالیز میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، تفرق نور دینامیکی (DLS) و فلوسایتومتری استفاده شد. یافته‌ها: با توجه به مشاهدات در هر سه غلظت سرم اتولوگ، گسترش سلولی مشاهده شد که مطلوب‌ترین نتایج در غلظت 15 درصد مشاهده شد. علاوه بر این، نتایج فلوسایتومتری حاکی از بیان مارکرهای مزانشیمی CD73 و CD105 در سلول‌های کشت شده با 15 درصد سرم اتولوگ بودند. هم‌چنین در بررسی‌های انجام شده به وسیله DLS، TEM و فلوسایتومتری اگزوزوم‌های جداسازی شده از محیط کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی کشت داده شده با سرم اتولوگ اندازه 30-150 نانومتری داشتند، مورفولوژی آنان فنجانی شکل بود و بیان مارکرهای اگزوزومی (CD9، CD63 و CD81 ) نیز در آن‌ها تایید شد. استنتاج: در نتیجه، با افزایش استفاده از سلول‌های بنیادی مزانشیمی در پزشکی بازساختی، اطمینان از ایمنی فرآیند و مواد مورد استفاده در این حیطه بسیار حائز اهمیت می‌باشد. بنابراین می‌توان گفت، سرم اتولوگ می‌تواند گزینه مناسبی برای کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از خون قاعدگی باشد.   Background and purpose: Menstrual blood-derived mesenchymal stem cells (MB-MSCs) expressing CD44, CD90, and CD105 markers were recently introduced. These cells are a good source of stem cells for research and use in regenerative medicine due to uncomplicated collection without invasive surgical intervention or ethical issues. Cell culture is one of the most essential techniques in molecular cell biology, and the culture medium is the most critical component. Serum is one of the crucial components of the culture medium and a protective solution. One of the most common serums used in cell culture is fetal bovine serum (FBS). This serum is an unknown mixture and can contain unfavorable factors such as endotoxin, mycoplasma, viral contaminants, or prion proteins. Therefore, there is a need for a human substitute for FBS that can be utilized for clinical applications. In this study, a humanized protocol utilizing autologous serum (AS) instead of FBS is tested to investigate the expansion of MB-MSCs and exosomes released from these cells. Materials and methods: A menstrual blood sample was collected from the donor on the second day of menstruation. Autologous serum samples were also collected to prepare the culture medium. First, mesenchymal stem cells were extracted from menstrual blood and then cultured in an environment enriched with autologous serum at different concentrations of 10%, 15%, and 20%. The investigation was done on the cells obtained in the third passage. Cultured cells in autologous serum were analyzed regarding expansion and expression of mesenchymal surface markers (CD73 and CD105). An inverted microscope was used to study the expansion, and flow cytometry was used to investigate the expression of mesenchymal markers. Also, in the next step, the culture medium of cultured cells in autologous serum was collected for exosome isolation. Exosome isolation was done by a three-step combination method of sedimentation, size exclusion chromatography with CL-2B sepharose resin, and making it concentrated. Finally, the purified exosomes were analyzed regarding morphology, size, and expression of CD9, CD63, and CD81 markers. Transmission electron microscope (TEM), dynamic light scattering (DLS), and flow cytometry analysis were operated, respectively. Results: According to the observations, cell expansion was observed in all three concentrations of autologous serum, and the most favorable results were marked in the concentration of 15%. In addition, flow cytometry results indicated the expression of mesenchymal markers CD73 and CD105 in cells cultured with 15% autologous serum. Exosomes were isolated from the culture medium of mesenchymal stem cells cultured with autologous serum, and their characteristics were investigated using dynamic light scattering, transmission electron microscope, and flow cytometry techniques. The size of the exosomes ranged from 30-150 nm, and their morphology was cup-shaped. The expression of exosome markers such as CD9, CD63, and CD81 was also confirmed. Conclusion: As a result, with the increase of using mesenchymal stem cells in regenerative medicine, it is imperative to ensure the safety of the process and materials used in this field. Therefore, autologous serum can be a suitable option for the culture of mesenchymal stem cells derived from menstrual blood.   سلول‌های بنیادی مزانشیمی خون قاعدگی, سرم جنین گاوی, سرم اتولوگ, اگزوزوم, پزشکی بازساختی Menstrual blood mesenchymal stem cells, fetal bovine serum, autologous serum, exosome, regenerative medicine 11 12 http://jmums.mazums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-7694-8&slc_lang=fa&sid=1 Zeinab Rezaei Kiasari زینب رضایی کیاسری z.rezaei@mazums.ac.ir 1003194753284600166143 1003194753284600166143 No MSc Student in Medical Biotechnology, Faculty of Advanced Technologies in Medicine, Mazandaran University of Medical Science, Sari, Iran دانشجوی کارشناسی ارشد زیست فناوری پزشکی، دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Amirali Khodashenas امیر علی خداشناس s.khodashenas@mazums.ac.ir 1003194753284600166144 1003194753284600166144 Yes Assistant Professor, Department of Medical Biotechnology, Faculty of Advanced Technologies in Medicine, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran استادیار، گروه زیست فناوری پزشکی، دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Marzieh Zamaniyan مرضیه زمانیان m.zamanian@mazums.ac.ir 1003194753284600166145 1003194753284600166145 No Associate Professor, Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran دانشیار، گروه زنان و زایمان، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Pedram Ebrahimnejad پدرام ابراهیم نژاد pebrahimnejad@mazums.ac.ir 1003194753284600166146 1003194753284600166146 No Associate Professor, Department of Pharmaceutics, Faculty of Pharmacy, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran دانشیار، گروه داروسازی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران Fatemeh Zare Taji فاطمه زارع تاجی f.zare.zt@gmail.com 1003194753284600166147 1003194753284600166147 No MSc Student in Medical Biotechnology, Faculty of Advanced Technologies in Medicine, Mazandaran University of Medical Science, Sari, Iran دانشجوی کارشناسی ارشد زیست فناوری پزشکی، دانشکده فناوری‌های نوین پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ساری، ایران